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    實(shí)時(shí)熒光定量PCR的優(yōu)化(四)

    發(fā)布時(shí)間: 2021-10-12  點(diǎn)擊次數(shù): 1395次

    這期我們來學(xué)習(xí)設(shè)計(jì)TaqMan探針,應(yīng)該考慮的因素有以下這些......


    1、TaqMan探針的最佳長度在20bp,不超過30bp,這樣才能實(shí)現(xiàn)熒光淬滅。有些情況下超過30bp也是可以的,需要將淬滅基團(tuán)設(shè)計(jì)在距離5'端18~25bp的地方。


    2、TaqMan探針的Tm值要比引物的高10°C,通常在65~70°C之間,確保探針比引物先結(jié)合在模板上。


    3、探針序列應(yīng)該避免連續(xù)的單堿基重復(fù)序列,尤其是G,因?yàn)檫@可能影響探針的二級結(jié)構(gòu),降低雜交效率。


    只能使用這種單堿基重復(fù)序列時(shí),可通過肌苷替代鳥嘌呤,中斷連續(xù)。


    如果是5'端有太多鳥嘌呤,也會(huì)產(chǎn)生不好影響,淬滅探針的熒光。


    4、TaqMan探針的GC含量應(yīng)該在50%。


    5、探針5'端應(yīng)該盡可能與3'端相似,保證Taq酶快速降解探針。


    6、制備好的探針應(yīng)采用HPLC純化


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