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    免疫熒光技術(shù)-直接法

    發(fā)布時(shí)間: 2021-10-26  點(diǎn)擊次數(shù): 1369次

    材料與儀器:

    抗體
    PBS 伊文氏蘭
    顯微鏡


    實(shí)驗(yàn)步驟:

    1. 標(biāo)本經(jīng)固定后,PBS洗滌3×3 分鐘;

    2. 加熒光素標(biāo)記的抗體,濕盒內(nèi)37 ℃孵育50 分鐘;

    3. PBS洗滌3×3 分鐘;

    4. 0.1 %伊文氏蘭復(fù)染;

    5. PBS洗3 次,蒸餾水洗2 次,每次3 分鐘,以除去NaCl結(jié)晶;

    6. 緩沖甘油封片,鏡檢。


    要點(diǎn):
    直接法比較簡(jiǎn)單,特異性也較高,但每種熒光抗體只能檢測(cè)一種相應(yīng)的抗原,應(yīng)用范圍較窄,敏感性也較低。

    對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的觀察、判斷與分析是影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重要環(huán)節(jié),判斷結(jié)果的好與壞、真與假需注意以下幾點(diǎn)。

    1、必須設(shè)立對(duì)照染色(陰性或陽(yáng)性對(duì)照),沒(méi)有對(duì)照染色的結(jié)果是沒(méi)有說(shuō)服力的。

    2、正確判斷真陰性和假陽(yáng)性。

    (1)了解抗原表達(dá)是否在特定部位,如VP陽(yáng)性出現(xiàn)在神經(jīng)元胞漿,F(xiàn)os標(biāo)記細(xì)胞胞核,若陽(yáng)性產(chǎn)物不在抗原所在部位,通常認(rèn)為是假陽(yáng)性。

    (2)對(duì)陰性結(jié)果,不能視為抗原不表達(dá),應(yīng)該參考他人的結(jié)果或進(jìn)行相應(yīng)的對(duì)照實(shí)驗(yàn),尋找原因,判斷是否為真陰性。

    (3)在切片破損區(qū)域,出血壞死灶或刀痕等位置容易出現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá),應(yīng)鑒別分析。

    (4)染色時(shí)間的掌控很關(guān)鍵,可以避免非特異著色或假陽(yáng)性細(xì)胞。

    3.所有免疫組化操作步驟均能影響其結(jié)果,判斷的關(guān)鍵在于以下幾點(diǎn)。

    (1)組織切片完整,結(jié)構(gòu)清晰,說(shuō)明灌注取材、脫水、制片過(guò)程中沒(méi)有問(wèn)題。

    (2)切片著色鮮艷,說(shuō)明抗體種屬之間配伍沒(méi)有錯(cuò)誤,染色步驟正常。

    (3)陽(yáng)性與陰性結(jié)果部位明確,說(shuō)明所用抗體的特異性強(qiáng)。

    4.切片例數(shù)、陽(yáng)性產(chǎn)物數(shù)量統(tǒng)計(jì)、分析應(yīng)符合統(tǒng)計(jì)學(xué)要求。



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