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    補(bǔ)體介導(dǎo)法

    發(fā)布時(shí)間: 2022-03-11  點(diǎn)擊次數(shù): 1004次

    原理


    帶有特異抗原的靶細(xì)胞(如正常細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、病毒感染細(xì)胞)與相應(yīng)抗體結(jié)合后,在補(bǔ)體的參與下,引起靶細(xì)胞膜損傷,導(dǎo)致細(xì)胞膜的通透性增加、細(xì)胞死亡。染料(例如:伊紅-Y、臺(tái)盼藍(lán))可通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)使細(xì)胞著色,故可用于指示死細(xì)胞或?yàn)l死細(xì)胞,而活細(xì)胞不著色。此即補(bǔ)體依賴(lài)性細(xì)胞毒試驗(yàn),利用細(xì)胞毒試驗(yàn)可以檢查細(xì)胞膜抗原,亦可鑒定抗體的特異性。
     
    本實(shí)驗(yàn)中,Thy-1抗原是小鼠胸腺T細(xì)胞特異的表面抗原,在體外利用抗小鼠Thy-1的單克隆抗體通過(guò)補(bǔ)體的協(xié)同作用,可殺傷95%以上的胸腺細(xì)胞。
     


    材料與儀器

    C57BL/6J小鼠
    Hank’s液 單克隆抗體 補(bǔ)體 伊紅-Y染液
    眼科剪 眼科鑷 平皿 不銹鋼網(wǎng) 試管 吸量管 尖吸管 載玻片 蓋玻片 顯微鏡

    步驟


    一、實(shí)驗(yàn)方法
     
    1.  小鼠胸腺細(xì)胞懸液的制備:將4~6周齡小鼠采用頸椎脫臼法處死,取出胸腺放入已加入約4 ml冷Hank’s液的平皿中,在100目的不銹鋼網(wǎng)上研磨后,過(guò)篩,放入試管,離心1 000 rpm,5分鐘,用Hank’s液洗兩次。將沉淀的細(xì)胞重懸于Hank’s液中,配成1×107/ml細(xì)胞懸液。
     
    2.  取試管3支,標(biāo)明順序,依據(jù)下表依次加入1×107/ml胸腺細(xì)胞懸液、抗小鼠Thy-1的單克隆抗體(最適稀釋度)及Hank’s液,放入37℃水浴30分鐘。
     
    3.  取出后每管加入1%伊紅-Y染液1滴,混勻,室溫放置2分鐘。
     
    4.  重新混勻后分別在一張載玻片上滴片,加蓋玻片鏡檢。先在低倍鏡下觀察,再用高倍鏡觀察,比較3管中細(xì)胞死活情況。
     
    二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
     
    死細(xì)胞呈紅色,無(wú)光澤且腫脹變大;活細(xì)胞不著色、有光澤且形態(tài)正常。
     
    高倍鏡下計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞并計(jì)算其中死細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。計(jì)算公式如下:死細(xì)胞百分?jǐn)?shù)= EQ EQ \F(實(shí)驗(yàn)管死細(xì)胞數(shù)%-對(duì)照管死細(xì)胞數(shù)%,100%-對(duì)照管死細(xì)胞數(shù)%)


    注意事項(xiàng)


    1.  胸腺細(xì)胞制備速度要快,且需在冰浴中進(jìn)行操作,以保持細(xì)胞活力;
     
    2.  抗Thy-1的單克隆抗體和補(bǔ)體的效價(jià)要在預(yù)實(shí)驗(yàn)中確定;
     
    3.  細(xì)胞對(duì)照管死細(xì)胞數(shù)若超過(guò)5%,實(shí)驗(yàn)需重新做;
     
    4.  細(xì)胞滴加到載玻片上后長(zhǎng)時(shí)間放置不檢測(cè)也可導(dǎo)致假陽(yáng)性反應(yīng)。


    常見(jiàn)問(wèn)題


    一、實(shí)驗(yàn)材料
     
    1.  解剖器械(眼科剪、眼科鑷)、平皿、80~100目不銹鋼網(wǎng);
     
    2.  試管、1 ml吸量管、尖吸管;
     
    3.  載玻片、蓋玻片;
     
    4.  C57BL/6J小鼠;
     
    5.  含5%NBS的冷Hank’s液;
     
    6.  抗小鼠Thy-1的單克隆抗體(最適稀釋度,本室制備);
     
    7.  補(bǔ)體(豚鼠新鮮血清并經(jīng)小鼠胸腺細(xì)胞吸收,預(yù)先測(cè)定效價(jià)并稀釋為最佳稀釋度);
     
    8.  1%伊紅-Y染液。

    二、多重PCR的特點(diǎn)


    1.高效性


    在同一PCR反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)檢出多種病原微生物,或?qū)τ卸鄠€(gè)型別的目的基因進(jìn)行分型,特別是用一滴血就可檢測(cè)多種病原體。


    2.系統(tǒng)性


    多重PCR很適宜于成組病原體的檢測(cè),如肝炎病毒,腸道致病性細(xì)菌,性病,無(wú)芽胞厭氧菌,戰(zhàn)傷感染細(xì)菌及細(xì)菌戰(zhàn)劑的同時(shí)偵檢。


    3.經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便性


    多種病原體在同一反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)檢出,將大大的節(jié)省時(shí)間,節(jié)省試劑,節(jié)約經(jīng)費(fèi)開(kāi)支,為臨床提供更多更準(zhǔn)確的診斷信息。


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