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    如何提高細胞的轉(zhuǎn)染效率?

    發(fā)布時間: 2022-10-20  點擊次數(shù): 1407次
    • 總有一種轉(zhuǎn)染方法適合你



    一、

    怎樣提高細胞的轉(zhuǎn)染效率?有的同學做了轉(zhuǎn)染,連接目的基因的載體帶熒光,轉(zhuǎn)染后48小時在熒光顯微鏡下觀察,卻發(fā)現(xiàn)只有約百分之15左右的熒光,問該怎么提高轉(zhuǎn)染效率?有沒有必要接著往下做篩選?還是重新轉(zhuǎn)染一次?


    1、

    如果要是做穩(wěn)定篩選的話,15%的轉(zhuǎn)染率應(yīng)該夠了。

    提高轉(zhuǎn)染效率的話,可以適當降低轉(zhuǎn)染時細胞的密度(我試過60~70%的密度比90%更好一些),另外還有可能就是細胞的生長狀態(tài),還有在接種后24h內(nèi)進行轉(zhuǎn)染。


    2、

    轉(zhuǎn)染應(yīng)該在對數(shù)生長期內(nèi)進行才能保證轉(zhuǎn)染效率,因為該時期細胞生長狀態(tài)良好,容易吸收外源質(zhì)粒,而不同細胞株的對數(shù)生長期是有差異的,因此建議先繪制培養(yǎng)細胞的生長曲線、確定其對數(shù)生長期,然后再著手做轉(zhuǎn)染。


    二、

    有同學用293細胞包裝病毒,轉(zhuǎn)染有熒光(約百分之二十),但是感染總是沒有熒光,感染細胞狀態(tài)很好,第四天后開始變圓脫落。轉(zhuǎn)染后的細胞沒有抗性,不能篩。


    1、

    20%的轉(zhuǎn)染率太低了,一般用293T包裝慢病毒轉(zhuǎn)染率達到80%以上.轉(zhuǎn)染率太低和293T的代數(shù)有關(guān)系,還和質(zhì)粒的濃度和純度有關(guān)系。


    2、

    轉(zhuǎn)染的前一天將細胞傳代,根據(jù)你的細胞生長速度,傳成適當?shù)拿芏?,保證第二天細胞達到70%左右,做轉(zhuǎn)染。有的人用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染,由于脂質(zhì)體對細胞有毒性作用,細胞特別容易脫落,所以防止細胞脫落,是提高轉(zhuǎn)染效率的關(guān)鍵。


    3、

    轉(zhuǎn)染的效率根本上還是由細胞種類決定的,有些細胞系好轉(zhuǎn),效率高,有些就不怎么好了。但是我們還是可以盡可能的提高轉(zhuǎn)染效率,之前提過,細胞生長狀態(tài)要好,這個很重要。另外,每種細胞系都有自己的最好用的轉(zhuǎn)染試劑,要多看文獻知道這種細胞系用哪種轉(zhuǎn)染試劑最多。然后自己可以按照DNA和轉(zhuǎn)染試劑的比例做個曲線,看看reporter的表達效率,做到好的轉(zhuǎn)染效率。其實DNA的質(zhì)量也很重要,不僅僅是內(nèi)毒素影響細胞的生存,一般情況下DNA超螺旋最好比列越高越好。為了促進表達,轉(zhuǎn)染前線性化也可以。

    如果有些細胞系確實難轉(zhuǎn),就應(yīng)該考慮其他方法了,電穿,病毒之類的。amaxa的nucleofector可以直接把質(zhì)粒打到核里,很好用。


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