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    ELISA實(shí)驗(yàn)中常遇到的問題、產(chǎn)生的原因與解決辦法

    發(fā)布時(shí)間: 2021-09-10  點(diǎn)擊次數(shù): 5384次

    酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn),簡稱為 ELISA。ELISA 實(shí)驗(yàn)是一種非常經(jīng)典的免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)。雖然歷史非常悠久了,但是還是不斷地在臨床和基礎(chǔ)研究中得到應(yīng)用。其主要用于:免疫酶染色各種細(xì)胞內(nèi)成份的定位;研究抗酶抗體的合成;顯現(xiàn)微量的免疫沉淀反應(yīng);定量檢測體液中抗原或者抗體成份。小編總結(jié)了一些經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)。遇到的問題,可能的原因,解決方法。供大家參考。


    問題 1:陽性與陰性不能達(dá)到 2.1 的比值,陰性顏色太深。

    可能的原因:陰性對照(也就是陽性對照的除目標(biāo)抗原外的其它成分)中有某種成分與一抗作用。

    解決的方法:純化抗原除去干擾成分。


    問題 2:陽性與陰性不能達(dá)到 2.1 的比值,陽性顏色太淺。

    可能的原因有 3 個(gè): 1)一抗效價(jià)不好。 2)抗原太稀。 3)封閉時(shí)間過長。

    解決的方法: 1)換用一抗或增加一抗用量。 2)增加抗原濃度。 3)縮短封閉時(shí)間,封閉時(shí)間一般 37 攝氏度 3 個(gè)小時(shí),或者 4 攝氏度過夜。不能比這個(gè)更長了。


    問題 3:增加抗原濃度,一抗?jié)舛炔蛔?,顯色反應(yīng)沒有表現(xiàn)出應(yīng)有的梯度。

    可能的問題: 一抗與抗原的比例已經(jīng)飽和。

    解決的方法: 增加一抗用量; 或在一抗用量不變的情況下減少抗原濃度做梯度。


    問題 4:增加一抗?jié)舛龋@色反應(yīng)沒有表現(xiàn)出應(yīng)有的梯度。

    可能的原因:一抗與抗原的比例已經(jīng)飽和。

    解決的方法:增加抗原用量;或在抗原用量不變的情況下減少一抗?jié)舛茸鎏荻取?/p>


    問題 5:加完 TMB 顯色后顏色梯度很明顯,但加了硫酸終止反應(yīng)后顏色梯度沒有那么明顯了。

    可能的原因:硫酸可能把其它成分都炭化了。

    解決的辦法:加少一點(diǎn)硫酸,參考值:50 μlTMB+35 μl 硫酸;或者采用 1M 的 HCL 作為終止液,50ulTMB+50ul1M HCL。


    這些步驟里面,一抗和封閉是兩個(gè)關(guān)鍵。如果 ELISA 做不出滿意的結(jié)果,首先應(yīng)該從這兩個(gè)方面改進(jìn)。Elisa 實(shí)驗(yàn)看似簡單,其實(shí)不然。別小瞧了ELISA。光是一個(gè)加樣就有很多講究。


    ELISA 中加樣須注意如下問題:

    吸取樣品時(shí),加樣槍吸頭不應(yīng)黏附多余的液體;加樣時(shí)不可 90 度向孔中滴加液體,這樣會(huì)導(dǎo)致液體殘留在吸頭上,加樣不準(zhǔn)確! 不要將吸頭伸入孔中,一方面若接觸孔底可能壓彎吸頭,另一方面可能會(huì)將孔中的液體吹起來,加樣不準(zhǔn)確! 正確的加樣方法應(yīng)為 45 度,吸頭貼著孔壁加入,應(yīng)注意: 角度太小,會(huì)使液體殘留在孔壁上,導(dǎo)致加樣不準(zhǔn)確! 吸頭應(yīng)當(dāng)貼著管壁和液面的交界處!


    ELISA實(shí)驗(yàn)中常遇到的問題、產(chǎn)生的原因與解決辦法


    綜上所述,Elisa 實(shí)驗(yàn)看似簡單,其實(shí)還是有很多細(xì)節(jié)需要我們注意的。以上介紹了 Elisa 實(shí)驗(yàn)的一些經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn),希望對大家有所幫助。


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